NanoValid - Developing Reference Methods for Nanomaterials
나노기술은 수많은 핵심기술영역에 혁신을 일으키는 잠재성을 갖는 융합기술로 여겨지고 있다. 나노기술에 의한 혁신은 IT, BT, 메디컬 케어, 음식, 화장품, 자동화 산업 등 다양한 분야에서 나타나고 있는데, 이와 같은 획기적인 혁신을 가져올 수 있는 원인으로는 나노스케일에서 극적으로 변화하는 물질의 속성이 제기되고 있다. 그러나 이와 같이 속성이 변화된 물질이 인체와 환경에 유입되었을 때 어떠한 일이 일어날지에 대한 과학적인 이해도는 낮은 수준에 있다.
이러한 배경에서 EU의 FP7프로그램에서는 2011년 11월1일 NanoValid의 거대규모의 통합프로젝트로를 추진하면서 나노안전분야 프로젝트의 기함(flagship)들 중 하나로 시작하여 2015년까지 48개월 간 운영하기 시작하였다.
NanoValid의 주요 목적은 새로운 인증방법과 인증표준물질을 개발하는데 두고 있으며, 여기에는 특성화, 검출/정량화, 분산통제, 라벨링, 유해성발굴, 노출 및 위험성평가 등에 관한 방법을 포함하고 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해 NanoValid는 19개 국가의 29개 파트너와 2개 협력파트너로 구성된 컨소시엄을 형성하고, 관련분야의 프로젝트(특히, MARINA, QNano and NSC)와 규제 및 표준화기관과도 협력하고 있다. 그 외에도 NanoValid는 정책 및 규제의 개발 및 제공, 표준화, 산업R&D전략을 수립하고 있는데, 이러한 관정에서 유럽공동체위원회, EU의회, OECD, CEN, IOS, 유럽기술플랫폼및산업협회 등과 협력하고 있다.
NanoValid의 조직구조는 연구분야의 시계열적 흐름에 따라 역할을 부여하여 8개의 워킹팩키지(WP)로 구성된 조직을 구성하고 있다. 각각의 WP별 역할을 살펴보면 우선, WP1은 프로젝트의 전반적인 관리를 하고, WP8은 과학적 조정역할을 수행하여 프로젝트 성과향상을 위해 전체적인 과정의 관리자 역할을 하고 있다.
WP2는 테스트 물질을 제작하고, 테스트 방법을 선택하여 모든 파트너들에게 분배하는 역할을 하는데, 프로젝트 기간동안 13개의 프로토타입 물질을 선택하여 12개가 배포된 바 있으며, 이중 9개의 물질은 프로젝트에서 광범위하게 배포되어 평가된 바 있다. WP2에서 사용된 특성화 기법과 물질의 선택 및 배포현황은 아래의 표와 같다.
< WP2에서 선택된 물질 및 컨소시엄 내 배포 현황 >
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Sample |
Material |
Source |
Distribution |
WP2 status |
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NNV-001 |
SiO2 |
NLAB (in-house) |
WP2, 3, 5, 6 |
Full PC + Tox. screen. |
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NNV-002 |
SiO2 |
NLAB (in-house) |
WP2, 5, 6 |
Full PC + Tox. screen. |
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NNV-003 |
Ag(H2O) |
Colorobbia (Marina) |
WP2, 3, 5, 6 |
Full PC + Tox. screen. |
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NNV-004 |
Au(H2O) |
INMETRO (in-house) |
WP2, 3 (+Marina) |
Full PC + Tox. screen. |
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NNV-005 |
TiO2 |
CCMB (in-house) |
WP2 |
Full PC + Tox. screen. |
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NNV-006 |
CNTs |
Nanocyl (MARINA) |
WP2, 3 (+Marina) |
Full PC + Tox. screen. |
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NNV-007 |
Pd(H2O) |
Plasmachem |
WP5 TL |
Discarded |
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NNV-008 |
C60 |
Plasmachem |
- |
Discarded |
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NNV-009 |
SiO2(H2O) |
NLAB (in-house) |
WP5 TL |
Discarded |
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NNV-010 |
SiO2 |
Evonik |
WP5 TL |
Discarded |
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NNV-011 |
CuO |
Intrinsiq Materials |
WP2, 3, 5, 6 |
Full PC |
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NNV-012 |
ZnO |
Nanogate (NanoSustain) |
WP2, 3, 5 |
Tox. screen |
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NNV-013 |
TiO2 |
CCMB (in-house) |
WP2, 3, 5 |
discarded |
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* PC : physicochemical characterization * TL : task leader ※ 자료 : NSC(2016), Compendium of Projects in the European NanoSafety Cluster 2016Edition |
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< WP2에서 사용한 물리화학적 특성화 기법 >
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Diffraction (XRD) |
Crystalline phase |
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Scanning Electron Microscopy (SEM) |
Morphology, particle size (dry) |
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Transmission Electron Microscopy (TEM) |
Crystalline phase, symmetry of porous SiO2, chemical composition |
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Dynamic Light Scattering (DLS) |
Particle size (dry), agglomeration/aggregation |
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Z-potential |
Electrical charge |
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Brunauer–Emmett–Teller (BET) |
Surface area and porosity |
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Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) |
Chemical composition |
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※ 자료 : NSC(2016), Compendium of Projects in the European NanoSafety Cluster 2016Edition |
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WP3의 주요 역할은 체내외의 물리화학적 방법과 (가상실험의) Computational 방법의 타당성을 검증하는 것다. 이를 위해 나노물질의 입차 측정 및 테스트를 위한 11개의 표준운영절차(SOPs)를 실험실간 비교연구를 통해 개발하였는데, 이들중에서 5개는 타당성이 검증되었으나 6개는 검증되지 않고 있다. 이러한 과정에서 WP3는 사전 테스트된 4개의 프로토타입 4개의 물질(silica, gold, silver, MWCNT) 외에 3개의 추가물질들(copper oxide, zinc oxide, titanum dioxide)에 대해 일련의 실험실간 비교를 통한 광범위한 분석기법을 사용하여 특성화한 바 있다.
< Summary of the physicochemical characterization of the 3 ENMs (CuO, ZnO and TiO2) used in WP3 RR tests>
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Copper oxide |
Zinc oxide |
titanium dioxide |
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Source |
Suppplied by Intrinsiq materials |
Suppplied by Nanogate |
Synthesised by CCMB |
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Form |
Powders |
Powders |
Powders |
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TEM size |
24.5 ± 2.28nm |
13.6 ± 1.7nm |
< 5nm |
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DLS size |
155 ± 30nm |
87 ± 17nm |
99.75 ± 7.72nm |
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NTA size |
87 ± 10nm |
87 ± 17nm |
99.75 ± 7.72nm |
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BET surface area(m2/g) |
22.81 ± 3.72 |
57.55 ± 5.16 |
257.08 ± 46.77 |
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Phase |
Tenorite |
Zincite |
Particles are of anatase crystal structure. However, there was also the presence of rutile phase within the sample |
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XPS |
XPS analysis demonstrated the particles to be of CuO natrue and not of Cu2O |
No other elements apart from Zn and O was detected |
No other elements apart from Ti and O was detected |
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※ 자료 : NSC(2016), Compendium of Projects in the European NanoSafety Cluster 2016Edition |
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WP4는 위험성 평가(RA)와 생애주기평가(LCA)의 타당성이 검증된 방법을 적용한다. WP5는 인증방법과 인증표준물질을 개발한다. WP6은 타당성이 검증된 방법의 실현가능성을 평가하기 위한 사례를 연구하며, WP7은 보급, 활용, 훈련, 네트워킹 및 클러스터화를 담당한다. 지금까지 제시한 WP의 역할별 플로우 차트를 그림으로 제시하면 아래의 그림과 같다.
NanoValid에서 가장 특이한 사항은 물질의 생산 및 특성화와 독성테스를 위한 표준운영절차(SOPs: Standard Operating Procedures)를 홈페이지를 통해 제공하고 있다. 일부의 경우 검증단계까지 이르지 못한 초안수준의 일부내용이 있으나, 프로젝트의 종료에 따라 연구되었던 내용을 공개하고 있다. NanoValid에서 제공하는 SOPs의 대략적인 내용구성은 크게 물질생산과 특성화, 체내독성테스트, 체외독성테스트, 생태독성테스트의 4가지로 분류되고 있다. 이러한 4가지 분야의 구체적인 표준운영절차 내용구성을 간략하게 제시하면 아래의 표와 같다.
<표준운영절차의 구성>
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1. Material Production and Characterisation |
1.1 Synthesis |
Synthesis ofTiO2 nanoparticles [internal] |
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Synthesis of nanoporous silica nanoparticles[internal] |
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Synthesis of gold nanoparticles [internal] |
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1.2 Functionalization and Coating |
Coatingof TiO2 nanoparticles [internal] |
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1.3Material Characterisation |
Measurementof metals with flame AAS [internal draft] |
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WP3-BET analysis of ENMs [validated] |
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WP5-BET analysis of ENMs [validated] |
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WP3-DLS analysis of ENMs [validated] |
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WP5-DLS analysis of ENMs [validated] |
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WP3-TEM analysis of ENMs [validated] |
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WP5-TEM analysis of ENMs [validated] |
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WP3-XRD analysis of ENMs [validated] |
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WP3-Zeta potential measurement ofENMs[validated] |
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WP5-Zeta potential measurement ofENMs[validated] |
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XPS analysis of nanomaterials and alloys thinfilms [validated] |
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Chemical purity by ICP-MS [pre-validated] |
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1.4 Dispersion of ENPs |
Analysisof nanoparticles dissolution [pre-validated] |
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Dispersion on non-porous silica nanoparticlesin water [internal] |
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Preparation of NPs suspensions [internal draft] |
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Dispersion and analysis of nanomaterials – Part1: SiO2 LEVASIL [draft] |
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Dispersion and analysis of nanomaterials – Part2: SiO2 OX50 [draft] |
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1.5 Labelling of ENPs |
Referencequantification method for labelled NPs [draft] |
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2. In Vitro Toxicity Testing |
2.1 Preparation of Cells and Cell-derived Materials |
A549cell culture [validated] |
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A549 cell growth rate and viability [validated] |
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Caco-2 cell culture [validated] |
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HepG2 cell culture [validated] |
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NHEK cell culture [draft] |
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THP-1 cell culture [validated] |
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THP-1 cell growth rate and viability[validated] |
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2.2 Preparation of ENP Suspension in Cell Culture Media |
Dispersionof CuO nanoparticle suspensions for in vitro toxicological testing [draft] |
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2.3 Viability and Cytotoxicity Assays |
ATPassay with murine fibroblasts [internal draft] |
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ATP cell viability assay for silver (Ag)NP-treated A549 cells [validated] |
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Caspase 3/7 activity detection assay[validated] |
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Measurement of IL-1β and TNF-α secretion byELISA [validated] |
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Measurement of intra cellular Reactive OxygenSpecies (ROS) [draft] |
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MTS cell viability assay for gold (Au)NP-treated A549 cells [validated] |
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MTS cell viability assay for silver (Ag)NP-treated A549 cells [validated] |
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MTS cell viability assay for Copper Oxide (CuO)NP-treated Caco-2 cells [validated] |
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MTS cell viability assay for Copper Oxide (CuO)NP-treated HepG2 cells [draft] |
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MTS cell viability assay for silver (Ag)NPs-treated THP-1 cells [validated] |
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MTT with mesenchymal stem cells [internaldraft] |
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PI assay with mesenchymal stem cells [internaldraft] |
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PI assay with murine fibroblasts [internaldraft] |
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WST1 assay with murine fibroblasts [internaldraft] |
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2.4 Testing of Biological Functions on the Cellular Level |
Assaywith artificial membrane vesicles [internal draft] |
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2.5 Data and Records Management |
- |
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3. In Vivo Toxicity Testing |
3.1 SamplePreparation |
- |
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3.2 In Vivo Models |
Dataand records management for in vivo studies [draft] |
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3.3Dermal Testing |
Acutedermal testing [draft] |
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Nose model protocol for ENMs [draft] |
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Subchronic dermal testing [draft] |
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3.4 Inhalation Testing |
Lungexposure model [draft] |
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3.5Oral Testing |
Acuteoral testing [draft] |
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Subchronic oral testing [draft] |
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3.6 Biological Barriers Assessment Methods |
Earmodel [prevalidated] |
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3.7Bio-distribution Assessment Methods |
ENPbiodistribution assessment in organs and tissues by PIXE [pre-validated] |
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Quantitative Imaging of nanoparticle uptake anddistribution in environmental organisms by LA-ICP-MS [internal draft] |
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3.8Other Tests |
Caspaseactivity for assessing the effect of ENMs in in vivo systems [draft] |
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Genotoxicity assessment of ENMs by Comet assay[pre-validated] |
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Kidney model [draft] |
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MRI study on impact of ENPs on rat ear barriersto simulate skin, mucosa, and brain biological barriers [draft] |
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Multifunctional rat ear model for evaluatingimpact of ENMs on skin, mucosa, and nerve system [draft] |
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4. Eco-toxicity Testing |
4.1 Sample Preparation andDispersion |
Dissolutionassay with sensor bacteria for nanoparticles toxicity screening[pre-validated] |
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Dispersion of engineered nanomaterials inliquids for (eco)toxicological testing [pre-validated |
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Preparation of metallic NP samples fordissolution analysis in toxicity screening [draft] |
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Preparation of nanoparticle samples fortoxicity screening [draft] |
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4.2Feeding/digestion Protocols |
Feedingof NPS to isopods [draft] |
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Microwave acid digestion of organic material[draft] |
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4.3Cell-based Screening Assays |
ATPassay with protozoa [draft] |
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Bacterial bioluminescence inhibition assay[internal draft] |
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Bacterial growth inhibition assay [internaldraft] |
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Spot assay with microbial cells [draft] |
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Yeast growth inhibition assay [draft] |
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4.4Single-species Toxicity Tests |
Acuteimmobilization assay with crustaceans [internal draft] |
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Acute toxicity assay with zebrafish embryo[internal draft] |
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Artemia sp. nauplii viability test[pre-validated] |
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Cell membrane integrity with Porcellio scaber[internal draft] |
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Comet assay with Porcellio scaber [internaldraft] |
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Daphnia magna acute immobilization assay[internal draft] |
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※자료 :“www.nanovalid.eu/index.php/sops-standard-operating-procedures/1-material-production-and-characterisation/12-functionalization-and-coating”에서 재편집함 |
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* 링크사이트 : www.nanovalid.eu
